超敏版人腫瘤壞死因子α(TNF-α) 酶聯免疫吸附測定試劑盒

腫瘤壞死因子α（ TNF-α) 簡介：

腫瘤壞死因子α（ TNF-α)  由中性粒細胞、活化的淋巴細胞、 巨噬細胞、NK    細胞、LAK細胞、星形膠質細胞內皮細胞、平滑肌細胞和一些轉化細胞產生。 小鼠TNF-α以膜錨定的形式出現。 自然發生的TNF-α形式是糖基化的 ，但非   糖基化的重組TNF-α具有相當的生物活性。人類和鼠類的TNF-α在氨基酸水   平上顯示出大約79%的同源性。

實驗原理：

本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗（ ELISA） 。往預先包被有人 腫瘤壞死因子α(TNF-α)捕獲抗體的微孔中，依次加入樣本、標準品、生物素標 記的檢測抗體 ，HRP酶結合物 ， 中間經過溫育和洗滌 ， 用底物TMB顯色 ， TMB在過氧化物酶(HRP)的催化下轉化成藍色 ，并在酸的作用下轉化成最終的 黃色。顏色的深淺和樣本中的人腫瘤壞死因子α(TNF-α)呈正相關。用酶標儀在 450nm  波長下測定吸光度（ OD值） ，計算樣本濃度。

靈敏度：7.65pg/mL

特異性：可檢測樣本中人的TNF-α ,  且與其類似物無明顯交叉反應。

檢測范圍： 15.62-1000pg/mL

樣本稀釋：

請提前預估樣本的濃度范圍 ，如果您的檢測樣本需要稀釋 ，參考稀釋方案如下：

稀釋 100 倍：一步稀釋。取 5μL 樣本到 495μL 通用稀釋液內 ，做 100 倍稀釋；

稀釋 1000 倍 ：兩步稀釋。取 5μL 樣本到 95μL 通用稀釋液內 ，做 20 倍稀釋 ， 再取 5μL 20 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內 ， 做 50 倍稀釋 ， 總共稀釋 1000 倍；

稀釋 100000 倍 ：三步稀釋。取 5μL 樣本到 195μL 通用稀釋液內 ，做 40 倍稀 釋 ，再取 5μL 40 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內 ，做 50 倍稀釋 ，最后取 5 μL 2000 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內 ，做 50 倍稀釋 ，總共稀釋 100000 倍；每步稀釋時取液量不少于 3μL ，稀釋倍數不超過 100 倍。每步稀釋都需混合均 勻 ，避免起泡。

1.    從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條 ，剩余板條用自封袋密封 放回4℃。

2.    加樣 ：分別將樣本或不同濃度標準品按照100μL每孔加入相應孔中 ，空 白孔加入100μL通用稀釋液。蓋上封板膜后37℃溫育60分鐘。（建議：

將待測樣本用通用稀釋液稀釋1倍后再加入酶標板內測試。從而減   少基質效應對測試結果的影響 ，最后計算樣本濃度時需乘以對應的稀釋 倍數。所有的待測樣本和標準品在檢測中建議設立復孔）。

3.    加生物素化檢抗 ：取出酶標板 ，棄去液體 ，不用洗滌。每孔直接加入

100μL生物素化檢抗工作液 ，蓋上封板膜后37℃溫育60分鐘。

4.    洗板 ：棄去液體 ，每孔加入300μL 1x洗滌液 ，靜置1分鐘 ，甩去洗滌液， 吸水紙上拍干 ，如此重復洗板3次（也可用洗板機洗板）。

5.    加酶結合物工作液 ：每孔加入100μL酶結合物工作液 ，蓋上封板膜后 37℃溫育30分鐘。

6.    洗板 ：棄去液體按步驟4洗滌方法 ，洗板5次。

7.    加底物 ：每孔加入90μL底物(TMB) ，蓋上封板膜 ，37℃避光溫育15分鐘。

8.    加終止液 ：取出酶標板 ，每孔直接加入50μL終止液 ，立即在450nm波長 處測定各孔的OD值。

結果判斷：

1.    計算標準品和樣本復孔的平均  OD  值并減去空白孔的  OD  值作為校 正值。 以濃度為橫坐標 ，OD  值為縱坐標 ，在雙對數坐標紙上繪出四參 數邏輯函數的標準曲線。

2.    若樣本 OD  值高于標準曲線上限 ，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度 時乘以相應的稀釋倍數。

典型數據和參考曲線：

以下數據和曲線僅供參考 ，實驗者需根據自己的實驗建立標準曲線。

注意 ：本圖僅供參考 ，應以每次實驗數據所繪制標準曲線計算樣本含量。

1.    重復性 ：板內變異系數小于  10% ，板間變異系數小于  10%。

2.    回收率 ：在選取的健康人血清、血漿和細胞培養上清中加入  3  個不同 濃度水平的人TNF-α ,  計算回收率。

3.    線性稀釋：分別在選取的4份健康人血清、血漿和細胞培養上清中加入

高濃度人TNF-α ,  在標準曲線動力學范圍內進行稀釋 ，評估線性。